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【独家合作】气味遗传学(二):神经活动调控新技术

2024-04-16  阅读量:58

神经活动是人类认知、行为和感知的基础。研究大脑神经活动的主要目标之一是解开思维、情感和行为背后的奥秘,从而更深入地理解人类的本质。通过研究神经活动,科学家们致力于解决认知功能障碍、神经系统疾病等挑战,以提升人类生活质量。

神经活动调控是神经科学领域的热点之一,常见手段包括局部药理学、电刺激、磁刺激、光遗传学和化学遗传学等。然而,现有的手段都存在一定的缺陷,目前仍然缺少一种既可以实现精准调控又便于临床应用的神经活动调控技术。神经活动调控的发展为医学和科学领域带来了新的可能性,同时也需要持续的探索和改进,以更好地应对挑战和限制。

气味遗传学(Odorgenetic)是一种全新的、兼具光遗传学可开/关属性和高时-空分辨性以及化学遗传学简单易用等优点的细胞操控技术(详见:气味遗传学(一):一种全新的细胞操控技术)。该技术通过在靶细胞上特异性表达果蝇的2-戊酮的气味受体OR35a和共受体OR83b二聚体复合物(DORs),在施加2-戊酮后,2-戊酮能够与细胞膜上的DORs特异性结合并升高细胞内钙水平,从而调控钙依赖和电压依赖的细胞生理过程。因此,气味遗传学可以用来操控神经元放电、肌肉收缩和细胞分泌等活动。

下面具体看看Odorgenetic的作用机制以及体外/体内神经元活动操控效果:


1、利用DORs可以操控钙依赖和膜电位依赖的细胞生理过程
由于DORs在细胞膜上表达是DORs发挥作用的先决条件,因此,研究者首先利用免疫荧光组织化学方法验证了DORs在细胞膜上的表达定位。共聚焦成像的结果表明,在HEK293T细胞和培养的神经元中,OR35a和Orco主要表达在细胞膜上。为了进一步直接观察DORs的膜表达,研究者采用了带有CMV启动子、能够同时表达OR35a和Orco并连接有mCherry报告基因的质粒,荧光图像进一步证实了DORs主要表达在细胞膜上。
为验证2-戊酮是否能够与细胞膜上DORs特异性结合并引起DORs通道开放,研究者将DORs分别表达到Neuro-2a细胞(小鼠脑神经瘤细胞)和HEK293T细胞中,同时结合钙离子成像技术。结果显示,2-戊酮在表达DORs的Neuro-2a细胞和HEK293T细胞中引发了强劲的钙内流。
进一步,研究者通过将表达有DORs的HEK293T细胞浸泡在无钙或含钙的细胞外液中,确定DORs介导的钙内流完全依赖于细胞外的钙离子。此外,在表达DORs的Neuro-2a细胞中,无论采用无钙或含钙的细胞外液,2-戊酮均可以引起显著的膜电位去极化,这表明DORs介导的细胞内向电流不仅仅只依赖于细胞外钙离子,还依赖于细胞外其它阳离子。

这些结果表明,通过DORs可能有助于操控钙依赖和膜电位依赖的细胞生理过程,如神经元放电、钙触发的内分泌细胞分泌、钙触发的肌肉细胞收缩和钙触发的免疫细胞释放毒素。



图1. DORs介导的细胞钙内流和细胞膜去极化


2、利用DORs可以在体外/体内可逆地操控神经元激活

为了研究DORs是否可以用于操控神经元电活动,研究者将DORs表达到培养的皮质神经元中,并利用膜片钳来记录神经元的电活动。在电压钳条件下,研究者记录到DORs介导的跨膜电流呈2-戊酮剂量依赖性,2-戊酮的最佳浓度约为10 μM。在电流钳条件下,研究者记录到2-戊酮以剂量依赖的方式稳健地诱发了DORs表达神经元的动作电位。此外,研究者还在DORs表达的神经元中观察到了2-戊酮诱发的显著的钙活动。这些结果表明,DORs能够在体外介导2-戊酮驱动的神经元激活。

图2. DORs介导的体外培养神经元激活


为了研究DORs是否能操控小鼠神经元活动,研究者将编码DORs的慢病毒注射到C57小鼠的S1皮质,然后利用脑片膜片钳实验来记录神经元电活动。结果表明,10 μM的 2-戊酮能够稳健地诱发DORs表达神经元的动作电位。此外,研究者还通过脑片钙成像实验观察到2-戊酮诱发的DORs表达神经元明显的钙活动变化。

为了进一步研究DORs是否能在体内操控神经元活动,研究者将编码DORs的慢病毒和编码GCaMP的AAV注射到C57小鼠S1皮质,并通过在体双光子钙成像检测S1皮质神经元的荧光反应。结果显示,在吸入2-戊酮几分钟后,DORs表达的神经元被持续激活;重复吸入2-戊酮引发另一轮神经元放电。这些结果证实了DORs能够在体内可逆地操控神经元激活。


图3. DORs介导的脑片/在体神经元激活


综上,Odourgenetic通过2-戊酮与细胞膜上的DORs特异性结合,引起DORs通道开放,使得细胞钙内流和细胞膜去极化,从而可以操控钙依赖和膜电位依赖的细胞生理过程。体外/体内实验证明Odourgenetic能够可逆地操控神经元的激活,表明其可作为一种全新的神经活动调控手段。并且由于Odourgenetic具有操作简单、特异高效以及安全可控等优点,因此,Odourgenetic无论是对于基础科研还是对于临床疾病治疗都具有重要意义。

我司与该团队建立合作,可提供表达DORs的AAV病毒产品,详情请咨询。


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