腺病毒（Adenovirus,AdV）是直径约为70-100 nm、空间结构为立体对称的20面体、衣壳由252个壳粒组成的无包膜线性双链DNA病毒。目前已知的人腺病毒血清型有51种，根据组织嗜性不同被分成ABCDEF六个不同亚群，其中C亚群的第2和第5血清型为最常见的腺病毒载体。基于人腺病毒5型（Ad5）改造的载体使用较为广泛，其特点是人为地删除了E1和E3基因，导致腺病毒失去复制能力和一定程度上降低免疫原性，使得Ad5成为一种广泛、安全、有效的基因运输载体。腺病毒除了用作基因治疗药物载体和疫苗载体以外，在基础生物医学研究上也受到科研工作者的青睐，可以搭载最高达8 kb大小的目的基因。

腺病毒特性：

● 腺病毒基因组不会整合到宿主细胞中，可以直接进行翻译和转录，相比RNA病毒起效更快。

● 腺病毒感染能力强，转导效率高，是体外难感染细胞最佳选择；对于细胞实验在感染后36-48小时会出现表达高峰；对于动物实验则在5天左右即达到表达高峰，表达效果可维持1-3周左右。

● 腺病毒具有嗜肝性，尾静脉注射主要感染肝脏。

重组腺病毒包装系统是将外源基因克隆到穿梭载体上，再重组到腺病毒的大骨架载体（携带腺病毒主要功能基因）上。目前常用AdEasy系统和Admax系统包装重组腺病毒。

AdEasy系统：利用同源重组在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程。其优势在于可避免双载体在细胞中转染，大幅度降低非重组穿梭质粒造成的背景，提高腺病毒的出毒效率，缩短出毒时间。

Admax系统：将含有外源基因的腺病毒穿梭质粒和腺病毒包装质粒共转HEK293细胞，在Cre/Loxp或者Flp/Frt系统的作用下实现重组，产生重组腺病毒。该系统操作简便，获得较高的病毒滴度。

常用重组腺病毒包装系统比较：

我司使用AdMax系统包装重组腺病毒。

案例1：

为探究血管活性肠肽（VIP）在调节细胞骨架中的作用，既往研究表明，AnxA1-/-小鼠表现出脑微血管内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架扭曲，于是作者利用表达shANXA1的重组腺病毒载体感染人脐静脉内皮细胞（HUVECs），通过鬼笔环肽染色F-肌动蛋白，结果显示AnxA1敲低的HUVECs中观察到F-肌动蛋白纤维更细，VIP处理诱导了清晰的跨细胞F-肌动蛋白纤维的出现，表明肌动蛋白组织更正常。（客户文章，Lou X, Mou Q, Zhao B, et al. Oxid Med Cell Longev. 2021.）

案例2：

作者利用表达全长人ABCA1基因的重组腺病毒载体（Ad-ABCA1），研究ABCA1过表达对ANXA1亚细胞定位的影响及通过何种机制产生这种影响。Ad-ABCA1处理维持IR（缺血再灌注）后ANXA1的膜定位为探讨ABCA1过表达对ANXA1亚细胞定位的影响，视网膜切片上免疫染色检测ANXA1的表达。研究人员利用DAPI可视化细胞核，如图2所示，IR诱导ANXA1的核定位。而Ad-ABCA1处理，减少了ANXA1核内表达。此外，作者在HEK293细胞的膜提取物中测定ANXA1的表达，发现脂多糖（LPS）处理降低ANXA1表达，而Ad-ABCA1维持ANXA1的表达。

图2. Ad-ABCA1在体内外实验中对ANXA1核定位的影响

ABCA1通过与importin β（核转运受体）竞争减少ANXA1核定位

前人研究发现ANXA1核定位与importin β有关。然而，与ABCA1过表达相关的ANXA1核定位的减少是否是由于ABCA1与importin β竞争结合ANXA1尚不清楚。在HEK239细胞中LPS诱导ANXA1的核定位，但被Ad-ABCA1部分阻断。进一步发现，Ad-ABCA1降低ANXA1与importin β的结合；ABCA1表达的减少（siRNA）增加ANXA1与importin β的结合。此外，利用importin β1特异性抑制剂importazole（IPZ）阻断importin β功能。结果发现ABCA1siRNA增加ANXA1核定位，而IPZ部分阻断这种效果。（客户文章，Luo J, Wang S, Zhou Z, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021.）

图3. ABCA1过表达影响ANXA1核定位的作用机制

重组腺病毒体外感染细胞实例

重组腺病毒靶向小鼠肝脏实例

rAd5-U6-shRNA(NULL)-mCMV-ZsGreen

表达部位：小鼠肝脏

注射方式：尾静脉

注射剂量：1.0E+10 PFU/只

取样时间：注射后72 h取样

我司可提供AdV病毒定制包装服务

我司纯化重组腺病毒存储于腺病毒保存液中（如客户有需求，可换为PBS缓冲液），并采用干冰运输。收到重组腺病毒后，立即放置于-80℃，可保存约一年。若放置于-20℃则可保存2-3周。融解后的重组腺病毒可在4℃保存1-2周。请避免反复冻融。